16S测序介绍

16S rDNA是原核生物编码16S rRNA的基因，长度约为1500bp，由10个保守区和9个可变区（V1-V9）组成，可变区反映了物种间的差异性。16S rDNA-seq是通过提取微生物菌群的DNA，选择可变区的特定区段(V3-V4)进行PCR扩增，再通过高通量测序的方法，帮助研究人员分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。在医学领域，主要应用于肠道微生物与疾病的关联分析，揭示疾病与健康个体间微生物的差异，研究药物或饮食干扰后菌群差异，或某一病程发展过程中肠道菌群的变化，如结直肠癌等。

技术路线

• 宏基因组DNA提取：根据不同的样品类型采用不同的提取方案，获得高质量的宏基因组DNA。

• DNA质量检测：Nanodrop检测DNA样品浓度及纯度；琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。

• 16s可变区PCR扩增：引物设计扩增可变区的特定区段（V3-V4区）。

• 第二次PCR扩增：在DNA分子两端引入接头序列及index序列。

• 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布，Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序：根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析：下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析，提供全面数据分析报告。

样品要求

• 样品类型：Meta样品，如粪便、土壤、水样等或Meta DNA样品。

• 样品量：Meta样品请提供3g以上，DNA样品3 μg以上。

• 样品质量：DNA无明显降解，无蛋白污染，OD260/280值≥1.5，OD260/230值≥1.0，浓度≥30 ng/μL。

• 样品保存：DNA样品：可将DNA溶于Nuclease Free 超纯水中，-20℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

• 样品运输：样品置于1.5 mL管中，封口膜封好，冷冻运输。

测序方案

测序模式 Miseq PE300

测序数据量 0.05M clean reads

生物信息分析内容

基础分析   

1 原始数据处理及统计；

2 可变区域验证；

3 操作分类单元（OTU）聚类及分析；

4 单样本物种分类及丰度分析；

5 多样品物种丰度分析；

6 Alpha多样性分析

7 Beta多样性分析

高级分析

8 样品差异主要因子分析；

9 组间显著性差异分析；

10 系统进化树构建；

11 个性化分析